ИФА 2

Современные методы гормонального анализа

Проф. Н.П. ГОНЧАРОВ

Modern methods of hormonal analysis

N.P. GONCHAROV

ФГУ Эндокринологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Москва

Представлена характеристика основных методов определения гормонов, включая радиоиммунологические и иммуно-ферментные, а также подробно описаны современные методы иммуноанализа третьего поколения, обладающие высокой чувствительностью, что позволяет определять практически весь основной спектр гормонов и биологически активных соединений. Это открывает новые возможности в диагностике субклинических форм эндокринной патологии.

Ключевые слова: гормоны, методы анализа.

Key words: hormones, hormonal assays.

Одним из определяющих достижений современной биологии и медицины является создание во второй половине ХХ века методов радиоиммунологического определения гормонов и других биологически активных соединений в различных средах и тканях организма, позволяющих адекватно оценить функциональное состояние эндокринной или любой другой физиологической системы.

Появление радиоиммунологических методов относится к 1960 г., когда две независимые группы исследователей Yalow и S. Вегеоп в США и R. Ек1п в Великобритании) впервые описали метод определения инсулина и тироксина с помощью са-турационного анализа, основанного на принципе радиоиммуноанализа (РИА). В первом случае в качестве связывающего компонента были использованы антитела к инсулину, во втором — специфический транспортный белок к тироксину. Работа, посвященная РИА-методу определения инсулина, была удостоена Нобелевской премии.

Впоследствии были созданы и другие методы иммуноанализа. В отличие от ранее использовавшихся биологических и химических методов, иммунологические методы обладают значительными преимуществами.

В настоящее время радиоиммунологические и родственные им неизотопные методы образуют в совокупности единую биотехнологическую систему, позволяющую определять практически неограниченный спектр веществ. Доступность и широкое использование этих методов в виде коммерческих стандартизованных наборов приобретают опреде-

ляющее значение в развитии многих направлений в биологии, медицине и ветеринарии. Различные методы иммуноанализа позволяют определять различные биологически активные вещества с чувствительностью в диапазоне концентраций от 10-6 до 10-12 М и выше.

Общие принципы иммуноанализа

Основополагающим компонентом любого метода иммуноанализа являются антитела — поли-клональные и моноклональные, получаемые in vivo. Антитела, присутствующие в антисыворотке, обычно имеют молекулярную массу более 150 кД и принадлежат к классу иммуноглобулинов (Ig). Обычно в антисыворотке доминируют IgG, IgA и IgM. Варианты в структуре аминокислотных остатков Ig определяют различия в местах связывания антигена. Теоретически считается, что таких мест связывания может насчитываться до 1010.

Основной принцип иммуноанализа — это реакция антитела с антигеном. При взаимодействии антитела (АЬ) и антигена (Ag) образуется комплекс (Ab:Ag) по формуле: Ab+Ag^Ab:Ag.

Для методов иммуноанализа биологически активных соединений необходимы следующие составляющие:

—высокоочищенный антиген для иммунизации;

— антисыворотка с высокоспецифичными антителами;

— высокоочищенный меченый антиген с максимально высокой специфической активностью;

© Н.П. Гончаров, 2011 86

e-mail: goncharovN@endocrincentr.ru

— технология разделения свободного антигена от антигена, связанного с антителами.

Краткая характеристика основных компонентов

иммуноанализа

Антитела

Необходимо всегда помнить, что при разработке любых методов иммуноанализа определяющую роль играет оптимальный выбор высокоспецифических антител независимо от системы регистрации сигнала используемого меченого компонента. Нередко в коммерческих наборах выбор антител не оптимален, что может приводить к диагностическим ошибкам.

Поликлональная антисыворотка содержит несколько тысяч различных типов молекул IgG. Принципиальное отличие моноклональных антител — их идентичность. Они предпочтительнее в методе конкурентного иммуноанализа, так как меченый и определяемый антиген (вещество) конкурируют за один и тот же центр связывания. Знание специфичности их эпитопов имеет существенное преимущество при создании «сандвич»-анализа. Моноклональные антитела легко получать в больших количествах с помощью гибридомной технологии, что обеспечивает возможность стандартизации метода и тем самым воспроизводимость полученных результатов в течение длительного отрезка времени. Применение мо-ноклональных антител для иммуноанализа пептидных гормонов требует большой осторожности, так как их высокая специфичность может приводить к связыванию только одной изоформы того или иного гормона. Этот эффект может проявляться также при аффинной очистке пептидов.

Стандарты

Для пептидных и гликопротеиновых гормонов используются международные стандарты ВОЗ. Работу по их созданию и обновлению координирует отдел биологических стандартов Национального института медицинских исследований в Лондоне. Систематическая информация о стандартах публикуется в докладах ВОЗ. Высокоочищенные стандарты для низкомолекулярных соединений, например для стероидов, можно приобретать у коммерческих фирм или из международной коллекции стандартов стероидов в Национальном институте здоровья США.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Одной из причин несоответствия между стандартами является природная гетерогенность их молекулярной структуры, которая наблюдается в случае гликопротеиновых гормонов (тиреотроп-ный гормон — ТТГ, лютеинизирующий гормон — ЛГ, фолликулостимулирующий гормон — ФСГ), а также пролактина (Прл) и гормона роста (ГР). Содержание изоформ гормонов и их соотношение изменяется в зависимости от источника и технологии

получения гипофизарных гормонов. Другими причинами, влияющими на качество стандартов, могут быть процесс лиофилизации, а также условия и продолжительность их хранения.

Матрикс

Для разбавления стандарта часто используют сыворотки, буферные и белковые растворы. Состав этих растворов или «матриксов» может влиять на реакцию антиген—антитело, в результате чего возникают серьезные систематические ошибки, которые сопровождаются нарушением воспроизводимости результатов анализа. Это довольно распространенное в иммуноанализе явление обозначают «эффектом матрикса». Принцип сопоставимости анализов заключается в том, чтобы анализируемое вещество в пробе взаимодействовало в тех же условиях, что и в стандартном растворе. Матриксные эффекты чаще всего влияют на определение ТТГ, общих трийод-тиронина — ТЗ, тироксина — Т4, Прл, ФСГ, ЛГ и стероидов, если они предварительно не выделены из пробы экстракцией.

Для диагностического мониторинга и проведения научных исследований используются следующие основные методы гормонального иммуноана-лиза: метод радиоиммунного анализа, иммунофер-ментный метод (ИФА), сверхчувствительные методы третьего поколения, основанные на измерении усиленного люминесцентного сигнала или регистрации вычлененного во времени флюоресцентного сигнала и электрохимический метод иммуноанализа с использованием высокопроизводительных автоматических анализаторов ряда зарубежных фирм.

Методы радиоиммуноанализа

Неотъемлемым компонентом радиоиммунологического метода является применение радиоактивной метки (трития — 3Н или 1251) с высокой удельной активностью. Регистрация сигнала осуществляется с помощью специальных гамма- (для 1251) или бета-(для 3Н) счетчиков.

Наряду с достоинствами, общими для всех иммунологических методов, РИА-методы имеют и ряд недостатков. К ним в первую очередь относится использование радиоактивного материала (3Н или 1251). Для персонала лаборатории наличие в наборе радиоактивности не представляет опасности. Короткий период полураспада 1251 (4—5 нед) также ограничивает время использования РИА-наборов и тем самым снижает их диагностическую эффективность.

Неизотопные методы исследования

Создание 30 лет назад метода включения фермента в антитело или определяемый антиген обеспечило быстрое развитие иммуноферментных методов иммуноанализа. Наиболее широко в качестве

меченого компонента используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). ELISA получил наиболее широкое распространение при определении гормонов в эндокринологии. В качестве твердофазных носителей наиболее широко используются полистироловые микропланшеты. В ELISA используются конъюгаты антител с ферментом, которые, реагируя с соответствующими «хромогенными» субстратами, образуют окрашенные соединения с определенными оптическими характеристиками. Этот метод более производителен по сравнению с классическими жидкофазными методами РИА и ИФА. Однако необходимо помнить о недостатках метода. В частности, высокую точность измерений могут обеспечить только специальные анализаторы. Кроме того, свойства и качество полистироловых микропланшет, используемых в ELISA, при недостаточно оптимальной технологии их производства могут изменяться от партии к партии и даже от лунки к лунке, что драматически влияет на качество и воспроизводимость гормонального анализа.

Высокочувствительные методы третьего

поколения

Флюоресцентный иммуноанализ. Существует несколько разновидностей данного метода. В последние 30 лет большое распространение в гормональной диагностике получил иммуноанализ с флюоресценцией, отсроченной во времени (Delfia), где в качестве метки используется редкоземельный элемент европий. Это принципиально новый тип иммуноанализа. Дельфия позволяет определять стероидные гормоны в пикограммовых количествах, а гипофизарные — в концентрациях от 0,03 мЕд/л (для ТТГ) до 0,15 мЕд/л (для Прл). Дельфия является технологией выбора при проведении скрининга на врожденный гипотиреоз и ВДКН.

Люминесцентный иммуноанализ. Наиболее оптимальными методами иммуноанализа являются фотоэмиссионные или люминесцентные методы. Наибольшее применение в иммуноанализе получил метод с усилением люминесцентного свечения.

Метод усиленной люминесценции

Усиление реакции люминесценции достигается добавлением люминогенного субстрата, люми-нола или изолюминола и специального усилителя. Последний резко усиливает интенсивность и продолжительность свечения, что и обеспечивает высокую чувствительность и воспроизводимость метода. Световой сигнал регистрируется специальным анализатором (люминометры). Метод высокопроизводителен, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он наиболее оптимален при обследовании населения на гипотиреоз, так как по-

зволяет определять свободный тироксин в концентрации 8 пмоль/л. Высокая чувствительность определения низкого уровня ТТГ (<0,1 мЕд/л) позволяет использовать его для диагностики субклинических форм гипертиреоза, а также для панели гормонов репродуктивной системы и ряда других гормонов в микрообъемах сыворотки.

Электрохимический метод иммуноанализа как

прообраз биосенсорной технологии

Почти одновременно с разработкой ИФА-методов были созданы и применены электроды для определения биологических молекул. Первые электроды конструировались на основе ферментов в силу их высокой специфичности с субстратами. На этом принципе были разработаны ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины и других соединений, присутствующих в биологических жидкостях. Электрохимические методы имму-ноанализа создавались для объединения чувствительности электрохимического детектора и специфичности, присущей реакции взаимодействия антиген—антитело.

В настоящее время в амперометрическом варианте метода наряду с ферментными метками получили многообещающее развитие неферментные электроактивные метки в виде металлоорганиче-ских соединений. Электрохимический гормональный иммуноанализ используется в диагностике эндокринных нарушений, позволяя определить широкий спектр стероидных, гипофизарных гормонов и гормонов щитовидной железы. Эти методы лишены многих недостатков, свойственных спектроскопическим методам регистрации сигнала.

Всегда необходимо помнить, что способ лечения больного определяется клиническим диагнозом, поэтому аналитические методы в первую очередь должны отвечать требованиям правильной диагностики. Не следует полагать, что неизотопные методы иммуноанализа надо использовать только потому, что они являются более современными. Зачастую по точности полученных результатов они уступают РИА-методам, а для определения ряда ключевых гормонов (АКТГ, альдостерон, ренин и др.) их не удалось адаптировать.

Биосенсорные методы

В настоящее время созданы сенсоры для определения пикограммовых количеств как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных гормонов. Для определения требуемого уровня специфичности в определении гормона в ряде случаев используются в сенсоре белки рецептора конкретного гормона. Это требует высокого уровня специалистов в области молекулярной биологии. В РФ созданы надежные сенсорные технологии быстрого определения сахара в крови, что разительно изменило ситуацию

в выявлении больных сахарным диабетом 2-го типа на ранних этапах его развития.

Методы тандем-масс-спектрометрии и их

возможности

Появление и развитие современной технологии масс-спектрометрии в тандеме с высокоразрешающим жидкостным хроматографом, обеспечивающее высокую производительность, практически 100% специфичность, необходимую чувствительность и воспроизводимость, открывает новую эру в биохимии стероидов. В отличие от прежнего технологически трудоемкого комплекса газовый хроматограф/масс-спектрометр (GCMS) современная тандем-масс-спектрометрия (MS/MS) не требует трудоемкой процедуры подготовки исследуемого биологического материала. При наличии подготовленного специалиста MS/MS может быть использован и уже используется в развитых странах для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В качестве примера приведем современные возможности метода для анализа стероидных гормонов. Сравнительно недавно группа авторов из США опубликовала работу, в которой продемонстрировано, что технология MS/MS с использованием масс-спектрометра API-3000 обеспечивает возможность одновременного определения за 11 мин в 0,2 мл сыворотки 12 основных стероидных гормонов. Продемонстрирована высокая надежность метода. Технология MS/MS высокопроизводительна и экономична по сравнению с современными автоматическими анализаторами, которые требуют больших затрат на постоянное приобретение дополнительных расходных материалов (коммерческих наборов). В методе MS/MS расходные материалы сведены к минимуму. По всем указанным параметрам MS/MS — технология ближайшего будущего в гормональном анализе. Один подготовленный оператор может выполнять до 200 тестов в день. В настоящее время тандем MS/MS получает широкое распространение для рутинной диагностики в эндокринологических лабораториях и прежде всего для определения основного спектра стероидов С21, С19 и С18 ряда, а также их многочисленных метаболитов. Уже в настоящее время при выполнении скрининг-программ в развитых странах на выявление ВДКН у новорожденных с использованием в качестве маркера 17а-гидроксипрогестерона метод MS/MS (API-3000) незаменим. Он выступает в качестве «арбитра» при наличии ложноположи-тельных результатов, неизбежных при определении в кровяном пятне 17а-гидроксипрогестерона методом флюоресцентного иммуноанализа (Delfia). При скрининге на каждый истинный случай ВДКН приходится до 200 ложноположительных результатов, которые требуют внесения ясности с использованием MS/MS — ABI-3000.

Технология MS/MS может быть использована и уже используется для определения различных по химической структуре гормонов, включая ТТГ, свободный Т4, свободный Т3, метанефрины, эстрадиол и его метаболиты, а также ряд других гормонально-активных соединений.

Ошибки при использовании методов

гормонального анализа

Ошибки в процессе выполнения анализа могут произойти на трех его этапах: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом. По данным мировой литературы, ошибки, возникающие на преаналитическом, внелабораторном этапе, достигают 90% от общего числа.

Преаналитический этап. На этапе получения образцов и доставки их в лабораторию необходимо знать и учитывать следующие биологические параметры: возраст пациентов, пол, биологический ритм для каждого гормона, фазу менструального цикла, срок беременности, диагностические и лечебные процедуры, прием лекарственных препаратов, соблюдение диеты, стрессорные ситуации до и во время взятия крови и ряд других.

Аналитический этап. Аналитический этап заключается в правильной организации работы в лаборатории, включая конструкцию помещения, соблюдение температурного режима (18—25оС). Абсолютным требованием к работе лаборатории является организация внутреннего и внешнего контроля качества, что позволяет обеспечить оптимальную работу диагностической лаборатории.

В последние 5 лет опубликована серия оригинальных работ, в которых доказана неадекватность определения в крови общей циркуляции эстрадио-ла, тестостерона и других стероидов прямыми неэкстракционными методами, включая практически все используемые автоматические анализаторы. Как правило, они принципиально завышают концентрацию гормона, что входит в противоречие с клиническими проявлениями заболевания.

Количественные параметры содержания общего эстрадиола определяемые любым современным методом иммуноанализа, не отвечают требованиям лабораторной диагностики и требуют разработки альтернативных подходов для определения свободной формы эстрадиола, чем сейчас занимается лаборатория гормонального анализа ЭНЦ.

Колебания в содержании тестостерона и эстра-диола при использовании различных тест-систем требуют продуманного выбора нужного метода, что в свою очередь определяется диагностической и/или научной клинической задачей и ожидаемым диапазоном содержания тестостерона и эстрадиола в биологическом материале.

Неудовлетворительные результаты определения общего тестостерона автоматизированными систе-

мами послужили основанием для разработки альтернативных технологий и прежде всего прямого и доступного метода определения свободной формы тестостерона как наиболее адекватного маркера ан-дрогенного статуса у мужчин и женщин.

Клеточные мембраны слюнных желез являются природными разделительными фильтрами, и в слюнной проток проникают соединения только с низкой молекулярной массой (<400 Д), к которым относятся и тестостерон, и все другие стероиды, не связанные с альбумином и специфическим глобулином. Концентрация жирорастворимых свободных стероидов, таких как тестостерон, не зависит от скорости выделения слюны и соответствует уровню несвязанной формы стероида в сыворотке крови.

В лаборатории ЭНЦ был отработан такой метод определения свободного тестостерона в слюне с использованием высокоразрешающей технологии люминесцентного иммуноанализа (фирма 1ВЬ, Гамбург, Германия). Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность позволяет количественно определять очень низкие (3—5 пг/мл) концентрации тестостерона в слюне, что особенно важно для диагностики андрогенного статуса у женщин и детей.

Отработан также метод прямого определения свободного тестостерона в сыворотке. Для этой цели был использован метод ультрафильтрации (УФ) с помощью разделительных фильтров Ашюоп иИга-4 («МИНроге») с порогом отсечения 30К-30,000

кмт.

Наши результаты сравнительного анализа определения свободного тестостерона с использованием технологий, отработанных в лаборатории гормонального анализа, и общепринятого расчетного метода, предложенного А. Уегшеи1еп и соавт., представлены в таблице.

Если при анализе результатов в качестве пограничного критерия норма/андрогенный дефицит использовать нижний предел референсных значений, то, по данным расчетного метода А. Уегшеи1еп, сниженная концентрация свободного тестостерона определялась в 15% случаев; по результатам определения в слюне — в 18% случаев, при определении общего тестостерона в сыворотке и свободного тестостерона в сыворотке с предварительной ультрафильтрацией — в 20 и 38% случаев. Иными словами

УФ-метод более чувствителен для диагностики ан-дрогенного дефицита.

Постаналитический этап. Полученные результаты проверяются и анализируются высококвалифицированным сотрудником лаборатории и поступают к врачам клиники или поликлиники. По данным зарубежных авторов, до 30—40% назначений для выполнения гормональных анализов не имеют оснований и могут дезинформировать врача в постановке диагноза. Для исключения таких ошибок необходимо тесное ежедневное взаимодействие сотрудников лаборатории и клиники при обсуждении и трактовке полученных результатов.

Определяющие факторы при выборе метода

анализа

Выбор метода анализа прежде всего зависит от аналитической характеристики метода. Основные из них следующие:

— чувствительность тест-системы, которая детерминирована аффинностью антител, а также технологической конструкцией системы и разрешающей способностью прибора при регистрации сигнала;

— диапазон определяемых концентраций соединений, который определяется калибровочной кривой;

— специфичность тест-системы, которая определяется процентом перекрестных реакций с близкородственными соединениями;

— степень линейности и процент открытия внесенного в пробу стандарта (она должна быть в пределах 90—104%);

— воспроизводимость получаемых результатов (допустимые значения — до 15% между постановками в разные дни);

— трудоемкость в проведении анализа;

— стоимость тест-системы (к сожалению, этот фактор часто доминирует). Как правило, низкая стоимость набора не может обеспечить необходимое качество, которое определяется сбалансированными вышеперечисленными параметрами.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В заключение необходимо отметить поступательное развитие эндокринологии как общебиологической науки за последние 50 лет. Успехи во многом определились достижениями в области фундаментальной науки — химии, физики и биологии. Клю-

Количественная характеристика (Ме, 10-90 процентилей) свободной формы тестостерона (Т) у взрослых мужчин в зависимости от метода определения

Метод Здоровые мужчины (25—52 года) Мужчины с андрогенным дефицитом (21—54 года)

Общий Т, нмоль/л 18,8 (12,4—26,1) 6,7 (1,2—10,8)

Свободный Т в крови (расчетный), пмоль/л 374 (225—544) 135 (9,3—215)

Свободный Т в слюне, пмоль/л 380 (270—544) 215 (55—250)

Свободный Т в крови (УФ-метод), пмоль/л 230 (110—370) 85 (12—197)

чевым моментом в развитии послужили работы о гуморальной природе передачи нервного сигнала и открытие биологическими методами активных соединений, выделяемых эндокринными железами. Ученые в разных странах буквально начали «атаку» по расшифровке их химической структуры. На этом этапе большую роль сыграли физико-химические методы в комбинации с биологическим тестированием выделенных гормонов. Параллельно шли работы по их синтезу, которые увенчались созданием целого ряда гормональных препаратов, обеспечивающих прогресс в клинической эндокринологии. Дальнейший прорыв в развитии эндокринологии обеспечило открытие в 1960 г. метода гормонального иммуноанализа, который обеспечил новые возможности определения гормонов в различных биологических средах в пикограммовых количествах, недоступные для клас-

сических физико-химических методов. Параллельно шло создание и развитие методологии и технологии методов молекулярной эндокринологии с генетикой, которые позволили расшифровать взаимодействие рецепторного аппарата тканей-мишеней с гормоном, идентифицировать генетический контроль этого ключевого процесса, а также установить структуру многих рецепторов и контролирующих генов. Появление более чувствительных методов определения гормонов и их широкая доступность открыли новые возможности в диагностике субклинических форм эндокринной патологии. Однако всегда необходимо помнить неизменное правило — окончательный диагноз определяется клиническими параметрами болезни, опытом и знаниями лечащего врача, а все используемые методы важны, но они имеют вспомогательный характер.

Иммуноферментный анализ: виды и основные отличия

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа — непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

А зачем вообще мне проверяться на ВИЧ?

Тестирование на ВИЧ — это единственный способ определить есть ли у Вас ВИЧ или нет. Когда Вы знаете свой ВИЧ-статус, Вы уверены в своём здоровье и знаете, что не заразите своего любимого. Чем раньше выявлен ВИЧ, тем раньше можно начать лечение и сохранить своё здоровье.

Обязательно сдайте анализ на ВИЧ, если:

  • у Вас было соитие без барьерной защиты,
  • Вы пользовались использованным иглой, шприцем,
  • у Вас был рискованный контакт и это Вас очень беспокоит. Лучше один раз провериться, чем долго мучаться от страха неизвестности.

Многие люди боятся сдать тест на ВИЧ, а зря. Лучше сдать и знать о своём ВИЧ-статусе, чем напрасно переживать (если ВИЧ минус) или заражать других (ВИЧ плюс).

Почему не надо бояться сдать анализ на ВИЧ?

  • Это очень легко и быстро. Провериться на ВИЧ легко и быстро можно с помощью экспресс-теста слюны или крови.
  • Лучше знать. Это нормально бояться сдавать на ВИЧ. Но нужно пересилить себя и поставить точку в этом, это намного лучше, чтобы или забыть об этом (при условии исключения рискованного поведения) или начать немедленно лечение при положительном результате.
  • Поможет прожить долгую и счастливую жизнь. Если у тебя обнаружат ВИЧ на ранних стадиях, то жизнь не кончилась, а наоборот только начинается + можно рано начать терапию и избежать СПИДа. При правильном лечении и уходе, человек инфицированный ВИЧ может прожить жизнь качественно, как средний ВИЧ-негативный.
  • Лечение бесплатно. Если у тебя выявят ВИЧ, то ты будешь получать бесплатно дорогостоящие лекарства, которые снизят вирусную нагрузку и укрепят иммунную систему.
  • Здоровая половая жизнь. Если ты будешь знать свой статус и ВИЧ результат твоего партнёра, то ты будешь спокоен за ваши половые отношения соития. Вы ничем друг друга не заразите.

Да не оскудеет рука дающего Проект «СПИД.ВИЧ.ЗППП.» — некоммерческий, созданный добровольцами-экспертами в области ВИЧ/СПИДа за счет своих собственных средств, чтобы донести правду людям и быть чистыми перед своей профессиональной совестью. Будем благодарны за любую помощь проекту. Да воздастся Вам в тысячи крат: ПОЖЕРТВОВАТЬ.

Краткая история тестирования на ВИЧ.СПИД

1981 г. — первый случай СПИДа.

1984 г. — выявление ВИЧ.

1985 г. — сертифицирован первый тест на ВИЧ.

1987 г. — создана первая тест-система Вестерн Блот.

1992 г. — внедрен первый быстрый тест.

1994 г. — создан первый тест определения ВИЧ по слюне.

1996 г. — первый домашний тест и тест определяющий ВИЧ по моче.

2002 г. — первый экспресс тест на ВИЧ из пальца.

2004 г. — первый экспресс тест определения ВИЧ в слюне.

Когда надо обязательно провериться на ВИЧ?

  • Если у Вас был риск заражения ВИЧ, то немедленно обратитесь к врачу.
  • Неплохо завести себе такую привычку — каждый год обследоваться на ВИЧ.
  • Если Вы беременная, то очень важно сдать анализ на ВИЧ, чтобы предотвратить заражение ВИЧ-инфекцией ребенка.
  • Отрицательный результат теста не всегда означает отсутствие ВИЧ, помните о существовании феномена «окна», который для каждой тест-системы свой.

Обследоваться на ВИЧ можно в любое время, особенно, когда был контакт с ВИЧ-положительным человеком или неизвестно болеет она/она ВИЧ-инфекцией или нет.

Если даже Вы думаете, что у Вас не было риска заразится ВИЧ — обследуйтесь хотя бы 1 раз в год. Это нисколько не помешает и Вы сами будете спокойны и уверены.

Как правильно называется анализ крови на ВИЧ?

ИФА, Иммуноблот, ПЦР.

У меня был риск заражения ВИЧ, когда сдавать анализы?

Если у Вас было незащищенное соитие или Вы пользовались использованным шприцем, иглой (даже если она «стерилизованная»), то не медлите и как можно быстрее обратитесь к врачу для определения риска заражения ВИЧ и назначения анализов и постконтактной лекарственной профилактики.

Современные тесты на ВИЧ могут определить наличие ВИЧ с 11 дня после заражения. В зависимости от типа тест-системы для определения ВИЧ придется походить к врачу даже в течении год (редко, обычно меньше) для того, чтобы избавиться от всех сомнений, что тебя «пронесло».

Через сколько недель от контакта можно выявить, что заразился ВИЧ.

Какой тест на ВИЧ лучше выбрать в зависимости от того сколько прошло времени после опасного контакта?

Все тесты имеют разный период окна — это то период, когда ВИЧ есть в организме, но ещё не определяется, что он есть с помощью анализов. То есть анализ может показывать отрицательный результат, а ВИЧ на самом деле есть и с течением времени результат станет положительным, т.е. тест-система с помощью, которой делают анализ на ВИЧ «увидит», что он есть.

Если опасный контакт был в течении последней недели, то требуется тест-система с меньшим периодом окна. Если рискованный контакт был 6 месяцев назад, то подойдет тест-система с большим периодом окна.

Прошло не более 3 дней после контакта с ВИЧ+

Если прошло не более 72 часов, то к сожалению определить заразились ли Вы ВИЧ невозможно. Вам нужно срочно обратиться к врачу СПИД-центра для назначения профилактической терапии.

Прошло 2 недели после контакта с ВИЧ-инфицированным

Можно использовать анализ ПЦР для определения ДНК/РНК ВИЧ.

Прошёл месяц после рискованного контакта человеком у которого может быть ВИЧ

Подойдет метод ИФА с помощью тест-систем 4-го поколения.

Если Вы уверены, что заразились (что, обычно, в 99% неправда), помни, что человек инфицированный ВИЧ больше всего заразен и представляет опасность для своих контактных именно в ранние стадии ВИЧ-инфекции. Поэтому соблюдайте меры безопасности: или воздерживайтесь от соитий, психоактивных веществ или используй резиновое изделие номер 2.

Через сколько времени можно сдать последний анализ на ВИЧ, что бы быть уверенным на 100%, что не заразился ВИЧ?

Сдать последний раз на ВИЧ, забыть и впредь думать головой:

  • ИФА 4 поколения — 6 недель от предполагаемого риска;
  • ПЦР РНК ВИЧ — 4 недели от предполагаемого риска;
  • ИФА 3 поколения — 12 недель от предполагаемого риска.

Читать более подробно: О сроках сдачи на ВИЧ, чтобы не попасть в диагностическое окно.

Какого поколения был мой тест на ВИЧ?

Для Российской Федерации — обычно четвертого (для Беларуси, Украины — 3-го). В названии теста 4 поколения обычно присутствует что-либо из слов: «Combo», «At/Ag», «АТ/АГ», «антиген-антитело» или «p24». В любом случае, чтобы не гадать — узнайте точно у медработника. Вам обязаны предоставить данную информацию.

Я думаю, что у меня НЕ было риска заразиться ВИЧ, нужно ли мне тестироваться на ВИЧ?

По крайней мере 2 раза в год нужно обследоваться на ВИЧ и другие венерические заболевания, чтобы вовремя заметить болезнь и её вылечить и для уверенности — так спокойнее.

Я беременная, нужно ли мне обследоваться на ВИЧ?

Обязательно! Скорее всего тебе предложат сдать на ВИЧ уже в женской консультации или роддоме . Не отказывайся! Это важно для здоровья твоего ребенка. Если врач будет знать, что Вы ВИЧ-положительная, то он сможет помочь защитить ребёнка от заражения ВИЧ.

А можно ли узнать есть ли ВИЧ-инфекция без анализов?

Возможно с большой долей вероятности поставить диагноз «ВИЧ-инфекция», но ТОЛЬКО в стадии СПИДа. До СПИДа также можно ЗАПОДОЗРИТЬ ВИЧ-инфекцию. До стадии вторичных проявлений, СПИДа, особенно в латентной стадии ВИЧ-инфицированный будет выглядеть как обычный человек!

Читать:

Как выглядят больные СПИДом?

Как распознать ВИЧ? Как не пропустить у себя симптомы ВИЧ?

Как работают диагностические тест-системы для определения ВИЧ, СПИДа?

3-е поколение тестов (ИФА антитело)

Когда человек заражается ВИЧ, то в его организме вырабатываются антитела (защитники, специальные белки, которые атакуют вирус). Антительный ИФА тест определяет эти антитела в крови, слюне и моче. Если она находит антитела, это означает, что человек заражен ВИЧ. Этот тест точен только через 3 месяца после заражения, т.к. организму требуется время, чтобы выработать необходимый уровень антител, который сможет увидеть тест.

Что такое антитела?

Антитела — это белки иммуноглобулины, которые связываются с бактериями и вирусами и нейтрализуют их. Каждое антитело специфично, т.е. оно связывает и нейтрализует только один вид бактерий или вирусов и не действует на другие. Антитела у человека вырабатываются клетками крови — В-лейкоцитами.

Антитело — это белок (иммуноглобулин), который циркулирует в плазме крови и связывается с антигеном, вызвавшим его образование.

Что такое антигены?

Антиген — любое вещество (чаще белок, но может быть и углевод), вызывающее выработку антител лимфоцитами. Белки и другие вещества на поверхности любых «не своих» клеток рассматриваются как антигены и вызывают сходный специфический ответ, т.е. продукцию антител.

В случае с ВИЧ антигенами являются белки вируса.

4-е поколение тестов (Комбинированный антиген-антитело ИФА)

Тесты 4-го поколения также обнаруживают антитела (белки иммунной системы человека, которые вырабатываются в ответ на инфекцию), но и также антиген p24, поэтому определяют наличие ВИЧ раньше, чем тесты ИФА 3 поколения.

Антитела вырабатываются организмом в ответ на ВИЧ-инфекцию, но на их выработку нужно некоторое время («период окна»).

p24 антигены — это частицы самого вируса ВИЧ, их очень много находится в крови в первые несколько недель после инфицирования ВИЧ, именно, в эти первые несколько недель ВИЧ-инфицированный максимально заразен.

Антиген ВИЧ p24, который обычно и определяют тест-системы, это белок вирусного капсида (core компонент), суть — непосредственно кусочек вируса, понятно, что он начинает определяться в крови ранее, чем антитела. Т.е. «период окна» для теста 4 поколения совсем небольшой.

Когда же начинают обнаруживаться в большом количестве и антитела против ВИЧ, спустя некоторое время, то антиген p24 часто уже не выявляется, т.к. образуется комплекс между антигеном и антителами в крови, белок становится связанным с другим белком.

Тесты 4-го поколения могут выявить вирус ВИЧ через 11 дней — 1 месяц после заражения. Доказательства:

  • «The detection of acute HIV infection» J Infect Dis. 2010 Oct 15;202 Suppl 2:S270-7. Cohen MS, Gay CL, Busch MP, Hecht FM. — 17 дней;
  • «How can we better identify early HIV infections?» Rosenberg NE, Pilcher CD, Busch MP, Cohen MS. — 5-10 дней после возможности детекции методом ПЦР (7-10 дней);
  • «Diagnosing acute HIV infection» Expert Rev Anti Infect Ther. 2012 Jan;10(1):31-41. Yerly S, Hirschel B. — 20-25 дней для систем 3 поколения, и на 4 дня менее для систем 4 поколения (медианное значение, диапазон 2-14 дней).

Лабораторные ИФА-системы 4 поколения с очень высокой вероятностью «не пропустят» ВИЧ-инфекцию уже через месяц поле инфицирования.

Быстрые (экспресс) тесты

С помощью быстрых тестов результат на ВИЧ можно получить, где угодно на месте, даже в домашних условиях, НО … вероятность ложноположительного результата при использовании быстрых тестов намного выше, п.э. всё равно потом нужно переделывать на нормальных.

Наборы быстрых тестов для определения заражения ВИЧ.

Самотестирование

Для того, чтобы определить наличие ВИЧ у себя в домашних условиях, нужно купить в аптеке быстрый тест на ВИЧ. Обычно, в аптеке продаются тесты для определения ВИЧ по слюне, очень удобные. Точно следуй инструкции по применению теста. В случае положительного результата срочно обратись в местный СПИД-центр.

Как сдать анализ на ВИЧ?

Существует несколько учреждений, где можно пройти тестирование на ВИЧ. Можно сделать анализ в поликлинике по месту жительства. Для этого необходимо обратиться к участковому терапевту. Анализ проводится методом ИФА (иммуноферментный анализ). Результат готов обычно в течение 7 — 14 дней.

Пройти тестирование на ВИЧ можно в Центре по профилактике СПИД, если таковой имеется в Вашем городе. Здесь Вы можете сдать кровь анонимно, не предоставляя свои персональные данные. Результат будет готов в период от 2 до 7 дней (возможно, уже на следующий день).

В данных учреждениях анализ на ВИЧ проводится бесплатно. В частных медицинских центрах можно пройти тестирование на ВИЧ на платной основе. Здесь преимуществом является то, что анализ готов уже в течение нескольких часов-первых суток.

Возможно проведение исследования даже в домашних условиях с использованием экспресс–тестов, которые сейчас продаются в аптеках на территории Российской Федерации. С точки зрения здравого смысла это не лучший вариант, так как получив отрицательный результат, вы не можете быть 100% уверенными в том, что у Вас нет ВИЧ, а если он будет положительным, необходимо будет перепроверить его другим методом (ИФА), так как есть вероятность получения ложноположительного результата.

Новый алгоритм определения ВИЧ.

Что такое ложноположительный и ложноотрицательный результат при исследовании на ВИЧ?

Ложноположительный результат

Ложноположительный результат (когда инфекции в организме нет, а результат теста положительный), можно получить по ряду причин. Некоторые, так называемые, аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия и др.), аллергические заболевания в активной фазе, беременность, гормональные расстройства, острые инфекционные, онкологические заболевания, резко повышенные показатели компонентов крови (холестерин), недавно проведенные прививки могут приводить к появлению антигенов в крови человека, которые вследствие высокой чувствительности может «уловить» тест – система. Кроме того, к получению ложного результата может банально привести ошибки медицинского персонала,»человеческий фактор»:

  • неправильно промаркировали пробирки,
  • ошиблись при внесении образца во время проведения анализа,
  • ошибки при документировании
  • перепутали пробирки,
  • не тому выставили результат,
  • загрязнили пробу и т.д.

Ложноотрицательный результат

Ложноотрицательный результат (ВИЧ – инфекция есть, но результат теста отрицательный). Одна из частых причин получения такого результата – период «серологического окна». Другая причина – несостоятельность иммунной системы человека либо в конечной стадии заболевания – стадии СПИД, либо при приеме иммуносупрессивной терапии – после трансплантации органов, а также при иммунодефицитах. В этом случае иммунная система человека просто не в состоянии вырабатывать антитела к ВИЧ, которые определяются при проведении тестирования. Не исключены и факторы технического характера – погрешности при хранении и транспортировке сданной на анализ крови, при проведении анализа.

Что такое антитела к ВИЧ?

Антитела – это вещества – белки, которые вырабатывает иммунная система человека в ответ на внедрение в организм чужеродных агентов (бактерий, вирусов, паразитов). Их уникальность состоит в том, что они комплементарны (т.е. подходят как вилка к розетке) только к одному единственному инфекционному агенту. Проще говоря, антитела к возбудителю дифтерии бесполезны в борьбе с вирусом кори. Роль антител состоит в том, чтобы обнаружить чужеродный агент, связаться с ним и запустить иммунологический ответ, в результате чего возбудитель погибает, а человек выздоравливает. В случае с ВИЧ – инфекцией выздоровления не наступает вследствие того, что вирус поражает клетки иммунной системы.

Что такое период серологического окна (сероконверсии)?

Это период времени после заражения человека ВИЧ, когда вирус в крови присутствует и нередко в очень больших количествах, а антитела к вирусу иммунная система еще не успела наработать. У таких людей результат исследования на ВИЧ методом ИФА будет отрицательным, так как этот метод определяет антитела к ВИЧ в крови. Обычно антитела у большинства инфицированных людей появляются в крови в течение трех месяцев после заражения, у малого процента людей – через 6 месяцев, у единиц – в срок до года.

Что сдают для анализа на ВИЧ?

Для тестирования на ВИЧ методом ИФА берется кровь из вены. При использовании экспресс – тестов возможно использование крови из пальца, слюны и мочи.

Как подготовиться к сдаче анализа на ВИЧ?

Сдавать анализ на ВИЧ нужно натощак, так как некоторые вещества, поступающие в кровь после приема пищи, могут повлиять на точность тест – системы. Так, если в крови резко повышаются холестерин и липиды после употребления жирной пищи, это может привести к искажению результатов.

Какими методами лучше делать анализ крови на ВИЧ?

При первичном обращении пациента кровь исследуется методом ИФА. Его преимуществами являются очень высокие специфичность (то есть выявляются антитела только к вирусу иммунодефицита человека и к никаким другим) и чувствительность (определяются даже самые малые концентрации антител к ВИЧ).

Существуют так называемые экспресс- тесты для экспресс анализа на ВИЧ. Они основаны на методе иммунохроматографии. Для диагностики заражения ВИЧ этим методом можно использовать цельную кровь из пальца, слюну. Но достоверность этих быстрых тестов ниже, чем ИФА.

Частота ложноположительных результатов при их использовании достигает 1%. Согласно санитарным правилам «О профилактике ВИЧ — инфекции», исследование на антитела к ВИЧ с применением быстрых тестов должно сопровождаться обязательным исследованием той же порции крови с помощью стандартных лабораторных технологий, разрешенных к применению в Российской Федерации.

Диагностировать заражение ВИЧ можно и методом ПЦР (полимеразной цепной реакции), но не рекомендуется, т.к. очень дорогой, более длительный и технически более сложный, чем ИФА, что предполагает большие риски ошибок. Тестирование пациента при первом его обращении проводится всегда методом ИФА, так как он более прост в исполнении, не требует больших затрат времени и особых условий (ПЦР – лаборатории), но достаточно достоверен. Однако использование ПЦР позволяет диагностировать инфицирование в период серологического окна, начиная с 10 – 14 дня заражения. Следует учитывать и то, что чувствительность ПЦР достигает 98%, что ниже, чем у ИФА (более 99,5%). К тому же, анализ методом ПЦР платный и стоит недешево. Оптимальный вариант диагностики – метод ИФА с использованием тест – систем 4 поколения с определением и антител к ВИЧ, и р24 антигена. Это позволяет получить достоверный результат в период сероконверсии.

Читать подробнее: Что такое ПЦР диагностика ВИЧ?

Почему задерживают результат анализа на ВИЧ?

Выдача результата на ВИЧ задерживается в том случае, если был получен положительный результат исследования на ВИЧ. Дело в том, что в диагностике ВИЧ -инфекции существует определенный алгоритм. Если получен положительный результат, та же порция крови должна быть исследована в другой тест-системе другого производителя или формата теста. При получении повторного положительного результата проба исследуется в тест-системе опять же другого производителя или другого формата. При получении третьего «плюс»-результата, кровь передается для исследования в реакции иммунного блоттинга.

Что представляет собой тест иммунного блоттинга?

Это разновидность ИФА, где определяются не антитела ко всем компонентам ВИЧ, а антитела к конкретным белкам вируса. Суть в том, что вирус имеет в своем составе различные белки: оболочки, сердцевины и ферментные белки. На стрипе (полоске, похожей на тест на беременность) эти белки нанесены в виде полос. При взаимодействии с сывороткой инфицированного человека в результате ряда реакций эти полосы становятся видимыми. Если сыворотка не содержит антител к ВИЧ, то полоска остается чистой. Этот метод является референтным, те есть по его результатам в совокупности с клиническими проявлениями и эпидемиологическими данными (при наличии рисков заражения, незащищенные контакты, использование инъекционных наркотиков и др.) выставляется диагноз «ВИЧ – инфекция».

Почему после получения отрицательного результата на ВИЧ рекомендуют сдать кровь еще раз через 2- 3 месяца?

Чтобы исключить сдачу крови в период серологического окна. Нужно отметить, что в настоящее время для ИФА – диагностики используют тест системы 4 поколения, в которых определяются не только антитела к ВИЧ, но и антиген p 24, который появляется в крови с конца второй недели заболевания и является показателем размножения ВИЧ в крови. Это снижает вероятность получения ложноотрицательного результата.

График динамики появления маркеров ВИЧ.

Когда появляются маркеры ВИЧ, «период окна».

Как интерпретировать результат анализа на ВИЧ?

Отрицательный результат на ВИЧ

Если Вы сдавали кровь на ВИЧ методом ИФА, то результат «отрицательный» означает то, что у Вас не обнаружено антител к ВИЧ. Это свидетельствует либо о том, что Вы не инфицированы вирусом иммунодефицита человека, либо о том, что антитела в крови после встречи с ним не успели выработаться иммунной системой.

Что предпринять в этом случае, чтобы устранить все сомнения?

Пересдать кровь этим же методом через два – три месяца, что практически исключит заражение в случае получения отрицательного результата. Если же Вы человек тревожный, то третий повтор анализа еще через полгода означает , что у Вас нет ВИЧ в крови (при отсутствии, конечно же, рисков заражения в течение этого интервала времени).

Положительный результат на ВИЧ

При получении положительного результата либо формулировки «антитела к ВИЧ обнаружены», необходимо не останавливаться на данном этапе и обязательно продолжить обследование по нескольким причинам.

  1. Во–первых, есть вероятность получения ложноположительного результата. Возможно, у Вас имеются хронические заболевания, беременность или другие факторы, которые могут повлиять на процесс тестирования крови. Чтобы избежать ошибок в диагностике, имеется алгоритм исследования первично-положительной крови, состоящий из нескольких этапов.
  2. Во-вторых, если Вы действительно инфицированы ВИЧ, то качество Вашей жизни напрямую зависит от своевременного начала противовирусной терапии. Уже доказано, что при начале лечения в стадии острой ВИЧ – инфекции, продолжительность жизни ВИЧ – инфицированного пациента приближается к средней ее продолжительности у здорового человека.

Когда много лет назад мне поставили диагноз «ВИЧ-инфекция», то я думал, что теперь он будет подчинять всю мою жизнь. Но сегодня для меня ВИЧ — это крошечный вирус, который Я контролирую, а не он меня.

— Алексей.

Я сдавал быстрый тест в мобильном кабинете анонимного тестирования и никак не ожидал, что тест покажет мне положительный результат. Я выл как раненая белуга: «Кто будет растить моих детей??!!! Сколько мне осталось жить??» Но мне повезло, мне попался очень классный врач, и он мне сказал, что он знает кучу людей, которые живут с ВИЧ по 20 лет и нормально себя чувствуют и даже рожают по несколько детей, и это помогло мне пережить этот стресс. Я буквально жил его словами первые несколько самых тяжелых месяцев. И сейчас со мной всё в порядке, у меня прекрасные дети, семья, работа!

— Саша.

Помни! Сейчас ВИЧ-инфекция лечится, жизнь не закончилась, а начинается новая, переосмысленная жизнь и ВИЧ — это не приговор, при условии правильного, регулярного лечения с помощью антиретровирусной терапии. Обязательно регулярно посещай врача СПИД-центра, дай ему возможность выполнить свою работу и помочь тебе. Не подавайся идеям ВИЧ-диссидентов, это бедные, несчастные люди, которые оказались в глубокой яме и других туда тащут.

Также, заодно можно провериться и на другие инфекции передающиеся половым путем: сифилис, хламидиоз, гонорею, трихомониаз, гарднереллез.

Читать подробнее:

Где же Вам могут помочь в данной ситуации?

Если Вы сдавали кровь в поликлинике, Вас направят к врачу – инфекционисту. Если же анализ был сделан в частном центре анонимно или дома при помощи экспресс – тестов, Вы можете обратиться либо в Центр по профилактике СПИД, либо к инфекционисту в поликлинике по месту жительства. И помните, Ваша жизнь – в Ваших руках!

У кого обязательно берут кровь на ВИЧ?

На местах, в регионах для каждого кода могут быть небольшие вариации с литерами (например 118-а, 113-ч и т.п., но основные коды сохраняются.

Где можно бесплатно сдать анализ на ВИЧ?

Анализ на ВИЧ можно бесплатно и анонимно сделать в центрах по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями.

Москва

Санкт-Петербург

Екатеринбург

Челябинск

Уфа

  • ГБУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», ул. Цюрупы, 86 8 (347) 251-11-36 ufa.rcpbspid@doctorrb.ru ufaaids.bashmed.ru

Самара

  • ГБУЗ «Самарский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», ул. Ново-Садовая, 178а 8 (846) 374-31-80 samaraspidcenter.ru

Краснодар

Нижний Новгород

Новосибирск

  • Поликлиника ГБУЗ НСО «Центр СПИД», ул. Семьи Шамшиных, 40 (больничный корпус № 5) 8 (383) 218-20-42, 8 (383) 218-20-17 spidnso.ru

Иркутск

Кемерово

  • ГБУЗ КО «Кемеровский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», пр. Ленина, д. 121 «Б» 8 (3842) 54-27-49 ozpbs@list.ru kemspid.ru

Ростов-на-Дону

  • ГБУ Ростовской области «Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и ИЗ», ул. Станиславского, 91 8 (863)-263-3-240 rostov-aids.ru

Казань

  • ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Республики Татарстан», ул. Вишневского, 2а 8 (843) 236-22-72, 8 (843) 236-85-81 centre_spid@tatar.ru infospid.ru

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *